拉曼光谱仪在微生物研究中的应用
发布时间：2023-11-17作者：小编来源：网络点击：次
微生物与人类生活息息相关,在食品制造、食物安全、医疗卫生、生物能源等领域都有重要的价值。微生物研究的基础是分离和鉴定。以病原微生物为例,早诊断早治疗对于感染性疾病的诊治至关重要,直接影响患者预后。然而在实际的临床工作中,微生物的分离、鉴定依赖于培养,往往需要数天,甚至数周的时间。还有很多病原微生物的培养条件苛刻,甚至无法被培养。另外,抗生素应用、标本污染、多种病原菌混合感染等因素的影响,使得培养结果判断起来更加复杂。所以,加快微生物的培养、鉴定一直是微生物相关行业的努力方向。
从20世纪90年代开始,拉曼光谱技术被应用于微生物研究。该技术能够以相对较少的标本,快速、准确、无损伤地检测微生物,辅助进行单细胞研究。随着理论的创新、技术的进步、研究成本的降低,使得拉曼光谱表现出越来越高的应用价值。近年来相关研究突飞猛进,而国内拉曼光谱在微生物领域研究应用相对薄弱。本综述从拉曼光谱的基本原理开始拓展,阐述了拉曼光谱的基本原理及衍生技术,以及在微生物研究领域的新进展,包括鉴定数据库的建立、表面增强拉曼标记(ESRS-Tags)、同位素探针、光镊技术等。
1 什么是拉曼光谱
当光线透过物质时,会发生散射,大部分的散射光线与入射光线能量一致,称为弹性散射,而如果散射后光子能量发生变化,则为非弹性散射。这一现象在1982年由印度物理学家拉曼首次报道,将之命名为拉曼散射,该散射光线的光谱称为拉曼光谱[1]。根据散射后光子能量的变化情况,拉曼散射可以分为斯托克斯拉曼散射(Stokes Raman scattering)和反斯托克斯拉曼散射(antiStokes Raman scattering)。斯托克斯拉曼散射的能量较入射光线低,反斯托克斯拉曼散射则从被照射分子中获得能量。斯托克斯散射光线强度更大,更容易被接收。拉曼光谱反应的是物质分子内部化学键的情况,故而能够通过测定代谢分子情况确定微生物的种类、生理特征、营养情况和突变表型等。
发生拉曼效应的光子仅为入射光线的1/106,所以拉曼光谱的检测需要昂贵的仪器和专业的操作人员,这也极大地限制了拉曼光谱的研究和应用。为了增强拉曼效应,稳定拉曼光谱,加强特异性检测的能力,发展出了很多衍生方法。表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy,SERS),应用纳米级金属微粒(多为金、银)包裹或将待测微生物置于粗糙金属的表面能够将拉曼效应提高106～1014倍[2,3]。将用于SERS测定的纳米颗粒进一步修饰获得表面增强拉曼标记(ESRS-Tags),能够在抗体的作用下特异性结合待检测物,并且能够进一步强化拉曼效应,大大降低了对于标本量的要求[4]。当可激发物质被光线照射成为激发状态后,会产生不同能量等级的拉曼散射,被称作共振拉曼散射[5](resonance Raman scattering)。共振拉曼意味着使用不同的激发光线能够选择性地增强可激发物质的检测,特别适用于产色素微生物的检验。
2 拉曼光谱技术目前在微生物研究领域的应用
2.1 用于细菌代谢产物的检测
与显微技术结合的拉曼显微光谱学(Raman microspectroscopy)能够在0.5-1μm单细胞水平检测全细胞拉曼光谱指纹图谱(wholecell Raman spectroscopic fingerprints),故而能够在较少量的样本中检测出较低浓度的微生物[6]。全细胞拉曼光谱指纹图谱包含了细胞内所有生物学信息,包括核酸、蛋白质、脂质和糖类等,可以通过一些物质的特异表现来进行测定。以细胞壁研究为例,Lemma T等[7]应用纳米银颗粒完成了阴性菌和阳性菌SERS的测定,对比发现阳性菌会在497cm-1处形成一个代表细胞壁多糖类物质的波峰,这是阴性菌所没有的。
类胡罗卜素是一种细菌产生的色素,因结构不同而在共振拉曼光谱1 157cm-1和1 500-1 550cm-1的波谱上表现出特征性变化。德国科学家[8]通过这一原理成功从混合菌群种将5种不同的细菌分离出来。我国陶站华等[9]通过测定金黄色葡萄球菌拉曼光谱,发现1 523cm-1处的峰值强度与紫外可见光分光光度法所测得色素含量有很好的线性关系,相关系数为0.9772,以此建立了拉曼光谱测定金黄色葡萄球菌色素合成的方法。
拉曼光谱技术与同位素探针(Stable isotope probing,SIP)结合可以用于细菌代谢的检测,常用的同位素为2H,13C,15N[10]。若细菌利用13C为碳源进行生物合成,拉曼光谱会发生红移现象,其中最具有代表性的是苯丙氨酸的光谱变化。如果苯丙氨酸苯环第0、2、4、6位碳原子使用13C来合成,那么其对应的峰值会向前移动,从1 004cm-1处前移至969cm-1处[11]。LI等[12]人使用13C标记的CO2作为光合作用的原料,从野生型海藻中筛选出固碳作用更强的菌株。
2.2 用于细菌菌种及耐药性的鉴定
拉曼光谱的高敏感性使其能够在不同种的病原微生物之间表现出足够大的差异,从而完成鉴定而。并且由于其省略了培养过程,检测结果快速,能够极大地提高早诊断早治疗的能力。其鉴定过程类似于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDIT),通过已知分类的标准菌株进行拉曼光谱测定,建立拉曼光谱数据库,以电脑分析的方法建立预测模型,测量待测微生物拉曼光谱后使用模型完成鉴定[6]。
拉曼光谱鉴定系统仍然处于开发阶段,有些问题亟待解决。如菌株光谱的识别问题,金黄色葡萄球菌的SERS光谱与腺嘌呤的光谱类似,鲍曼不动杆菌的SERS光谱与黄嘌呤的光谱类似[13]。所以只有建立足够庞大的光谱数据库,才能建立准确地识别方法,保证鉴定的准确性。德国科学家检测了26种分枝杆菌,包括结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌等,共8845株菌株,建立了分枝杆菌的拉曼光谱数据库,能够将未知分枝杆菌鉴定至种水平,准确率达到了94.3%[14]。
菌种鉴定的准确性同样有赖于算法的优化。在一篇最新的研究中[15],实验人员将5种常见的尿路感染病原菌混合,使用了三种不同的多元变量分析方法(principal component analysis,PCA;partial least square-discriminate,PLS-DA;support vector machine,SVM)来构建预测模型,结果显示PCA、PLS-DA均存在缺陷,预测效果不佳,而SVM模型预测准确率达到了96%。
除了菌种的鉴定,拉曼光谱还能够直接检测菌株的耐药性。Tien N等[16]收集了尿路感染患者的脓尿标本,同时进行培养和拉曼光谱测定,培养后行药敏检测,将大肠杆菌分为产ESBLs(Extended Spectrum Beta-Lactamases,超广谱β内酰胺酶)组和非产ESBLs组,发现产ESBLs的大肠杆菌会在729cm-1处会比头孢菌素敏感的大肠杆菌呈现更低的峰值。
2.3 用于菌株的分离
拉曼光谱技术可以快速检测细菌,定位目标细菌,而不对细菌产生损伤。结合其他的单细胞分离技术,比如光镊技术,可以获得单细胞菌株。光镊技术(laser tweezers),也叫激光陷阱(optical trapping),能够通过强光束来控制单个细菌移动,从而达到单细胞分离的目的,对于混合菌群、苛养菌、异质性细菌研究有很重要的意义。
2018年德国科学家[17]开发了一块微流控芯片,结合光镊技术分离出单细胞大肠埃希菌,比较了有无抗生素压力下单细胞大肠埃希菌共振拉曼光谱的变化情况,发现了多个明显变化的峰,后续PCA分析峰值差异存在明显的统计学意义。对于单个细菌的耐药性研究能够让我们更好地理解异质性耐药的问题。
Huang W E等[18]从酿酒酵母、大肠埃希菌和荧光假单胞菌的混合液中,通过表面增强拉曼光谱测定,使用光镊技术分离,成功获得单细胞菌株,并且能够通过培养再次形成菌落,经鉴定为同一种菌株。另外还验证了单细胞测序的方法,接近一半的菌株基因组能被正确扩增。
3 总结和展望
拉曼光谱检测的优点显而易见:所需的样品量少、检测能力强、标本鉴定预处理简单、结果报告快、对于菌体无损伤、分离和鉴定可以同时进行。但是同样存在一些问题,比如拉曼光谱的高敏感性,细菌种类、生长环境、生长状态、标本制备过程等因素都能够影响光谱的形态[19,20]。而目前的鉴定系统主要针对少数几个菌种的混合标本,对于全菌种的鉴定还有一定的距离。拉曼光谱测定的入射光线波长、检测波谱范围、样本的预处理等均不统一,期待标准检测方案地制订,能过规范标本的获取、预处理、光谱数据处理等。
虽然目前这项技术还未足够成熟,不能直接应用于工作,而且存在各种问题,但是我们可以看到它具有革命性的潜能,值得推广研究。
